天麻醒脑胶囊的溶栓作用及对凝血系统的影响
杨建宇1，何波2，杨扬3，张小超2，郑金丹3，沈志强2*，（1．昆明医学院海源学院药理教研室，云南昆明650106；2．云南省天然药物药理重点实验室昆明医学院，云南昆明650031；3．云南省永孜堂制药有限公司，云南昭通650021）
［摘要］目的：探讨天麻醒脑胶囊的溶栓作用及其初步机制，同时评价其对凝血系统的影响。方法：采用改良的Charlton和Tamihisa方法评价天麻醒脑胶囊对电刺激大鼠颈动脉血栓的溶栓作用；应用ELISA方法测定天麻醒脑胶囊对家兔血浆组织型纤溶酶原激活物（tPA）和纤溶酶原激活物抑制物（PAⅠ-1）活性的影响。同时评价PUW对家兔优球蛋白溶解时间（ELT）、凝血酶原时间（PT）、白陶土部分凝血活酶时间（KPTT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原（Fib）含量和血液流变学的影响。结果：0.6，1.2g·kg-1天麻醒脑胶囊的再通率分别为40%，50%，再栓率分别为50%，40%;0.3g·kg-1的天麻醒脑胶囊对再通率和再栓率均无明显作用。0.5，1.0g·kg-1的天麻醒脑胶囊于末次给药后60，120min均明显抑制血浆PAⅠ-1活性60，180min显著提高血浆tPA活性。1g·kg-1天麻醒脑胶囊于给药后60，120min可明显缩短ELT，0.25，0.5g·kg-1的剂量则无明显影响。0.5，1.0g·kg-1的天麻醒脑胶囊显著延长KPTT和PT，明显降低Fib水平；3种剂量的天麻醒脑胶囊对TT及红细胞电泳、高切、中切和低切均无明显影响。结论：天麻醒脑胶囊显著提高闭塞颈动脉的再通率，同时降低再通后颈动脉的再栓率；抑制PAⅠ-1活性，同时提高tPA的活性可能是其具有较好溶栓作用的分子机制。天麻醒脑胶囊可影响内凝和外凝系统，减少血管壁纤维蛋白的沉积，也提示在临床用药过程中，有可能发生出血倾向，需密切监测患者的凝血系统。
［关键词］天麻醒脑胶囊；溶栓；组织型纤溶酶原激活物；纤溶酶原激活物抑制物；优球蛋白溶解时间；凝血系统；血液流变学
天麻醒脑胶囊主要由天麻、地龙、石菖蒲、远志、熟地黄、肉苁蓉组成，本项目组研究表明，天麻醒脑胶囊有较好的抗血小板聚集作用[1]，明显促进脑缺血再灌注损伤脑电图电位幅度的恢复，对脑缺血再灌注损伤具有较好的保护作用[2]，明显改善微循环、增加血脑通透性和脑血流量[3]。目前，临床主要用于血管性痴呆、头痛失眠等病症。本研究继续探讨天麻醒脑胶囊的溶栓作用及其初步机制，同时评价其对凝血系统的影响，为天麻醒脑胶囊的临床应用提供进一步的药理学实验依据。
1 材料
1.1 动物
日本大耳白兔，体重2～2.5kg，雌雄各半，雄性大鼠250～300g，均由昆明医学院实验动物中心提供。合格证号滇实动证字第2005018号（大鼠），SCXK（滇）2005-0008（家兔）。
1.2 药物与试剂
天麻醒脑胶囊，云南省永孜堂制药有限公司，提供，批号20070701，生产批准文号国药准字Z20027062，0.4g/粒（成人用量2.4g·d-1）。凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、白陶土部分凝血活酶时间（kaolin partial thromboplastin time，KPTT）及凝血酶时间（thrombin time，TT）、纤维蛋白原（fibrinogen，Fib）、组织型纤溶酶原激活物（tissue-type plasminogen activator，tPA）和纤溶酶原激活物抑制物（type 1 plasminogen activator inhibitor，PAⅠ-1）ELISA测定试剂盒均购自上海生物技术公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.3 仪速
SEN-7203型电刺激仪、DVM-4200型二（日本岛津公司）EL340全自动酶标仪（美国Bio-Tek Instruments公司），THZ-C恒温振荡器（江苏太仓实验设备厂）。
2 方法与结果
2.1 血栓形成与溶栓活性的测定
大鼠分为5组，每组10只。0.9%的生理盐水组，，0.3，0.6，1.2g·kg-1的天麻醒脑胶囊组和1.2g·kg-1的复方丹参滴丸组。连续灌胃7d。末次给药后，用改良的Charlton等方法[4]，即用30mg·kg-1的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，分离大鼠左颈总动脉，置2根银制电极（间距0，8cm），超声探针置远心端。用电刺激器以2mA的直流连续刺激大鼠颈动脉5min。用超声血流量仪连续探测颈动脉血流量。以血流量为刺激前的50％作为血栓形成。根据Tomihisa等方法［5］，以刺激结束后至血流量为刺激前的50％所需的时间定为血栓形成时间。形成血栓后再观察1h内血管再通情况；该段时间内，若血管没有再通，则认为再通失败。若再通，则继续观察血管开放状态1h。以≥50％或≤25％的刺激前血流量者判定为持续再通或继后的再栓塞；再通后1h内，每只动物的颈动脉血流量以刺激前血流量为基线可分为≥50％，＜50％至＞25％，≤25％。颈动脉血管开放程度分别为①持续栓塞（persisten occlusion，，PO），无再通；②再通与再栓塞交错出现（cyclic reflow，CR）；③再通后持续开放（persisten patency，PP），再通后无再栓塞。
结果表明0.6，1.2g·kg-1天麻醒脑胶囊的再通率分别为40％，50％，再栓率分别为50％，40％；0.3g·kg-1的天麻醒脑胶囊对再通率和再栓率均无明显作用；生理盐水组仅1只动物出现再通。复方丹参滴丸明显提高再通率同时降低再栓率（表1）。
2.2 对血浆tPA和PAⅠ-1水平的影响[6]
家兔分5组，每组6只，即0.9%的生理盐水，0.25，0.5，1.0g·kg-1的天麻醒脑胶囊组和0.5g·kg-1的复方丹参滴丸组。连续灌胃5d，分别于末次灌胃后颈动脉分别插入聚乙烯管，于末次灌胃后60，120，180min取血。用含有2％EDTA-Na2（含0.7%NaCl）的抗凝剂抗凝（血与抗凝剂体积比为9∶1）。于4℃3000r·min－1离心30min，得到贫血小板血浆（platelet-poor plasma，PPP），于－40℃冻存。按试剂盒说明书，应用ELISA方法于96孔酶标板上用全自动酶标仪测定血浆tPA和PAⅠ-1的活性。0.5，1.0g·kg-1的天麻醒脑胶囊于末次给药后60，120min均明显抑制血浆PAⅠ-1活性60～180min显著提高血浆tPA活性。0.5，1.0g·kg-1的复方丹参滴丸于末次给药后60～180min均显著提高tPA活性，降低PAⅠ-1活性（表2，3）。
2.3 对兔优球蛋白溶解时间（euglobulin lysis time，ELT）的影响[7]
健康家兔，雌雄各半，随机分为生理盐水组，0.25，0.5，1.0·kg-1的天麻醒脑胶囊组和0.5·kg-1的复方丹参滴丸组，每组6只。连续灌胃给药7d后，自家兔颈动脉取血于硅化的离心管中，3，8％枸橼酸钠抗凝（9∶1），4℃3000r·min-1离心10min得PPP，冰浴保存待用。给药前于第4，5肋间进针心脏取血1次，给药后30，60，120min分别自颈动脉取血。
取0.5mL PPP加至预先冷却并含有9mL蒸馏水的锥形离心管中，再加入1％醋酸溶液0.1mL充分混匀后置4℃冰箱内静置15min，优球蛋白呈絮状沉淀析出3000r·min-1离心5min以分离沉淀。弃去上清液，保留沉淀部分，将离心管倒置在滤纸上约2min，吸尽剩余酸液，再将离心管置37℃的摇床内，加0.5mL pH9.0的硼酸-硼砂钠缓冲液（6.7g硼酸＋13.4g硼砂钠，用1L蒸馏水溶解，将优球蛋白部分溶解），用玻棒轻搅1min，使沉淀溶解，再加25mmol·L-1 CaCl2溶液0.5mL混匀（纤维蛋白凝块形成）。管内液体开始凝固。记录从凝块开始形成至凝块完全溶解的时间，即为ELT。
结果表明，1g·kg-1天麻醒脑胶囊和0.5g·kg-1的复方丹参滴丸于给药后60，120min可明显缩短ELT，0.25，0.5g·kg-1的天麻醒脑胶囊则无明显影响（表4）。
2.4 对凝血系统及血液黏滞度的作用[8-9]
健康家兔，体重2～2.5kg，随机分为5组，每组6只，雌雄各半，即生理盐水组、0.25，0.5，1.0g·kg-1的天麻醒脑胶囊组和0.5g·kg-1的复方丹参滴丸组。上述组分分别以4mL·kg-1体积灌胃，连续7d。末次给药后1h取血。3.8%枸橼酸钠的抗凝血室温下3000r·min-1离心10min得PPP用于测定PT，APTT，TT，Fib。肝素化抗凝血用于测定全血黏度（红细胞电泳、高切、中切和低切）。结果表明0.5，1.0g·kg-1的天麻醒脑胶囊和0.5g·kg-1的复方丹参滴均显著延长KPTT和PT明显降低Fib水平；3种剂量的天麻醒脑胶囊对TT无明显影响（表5）。复方丹参滴丸和3种剂量的天麻醒脑胶囊对红细胞电泳、高切、中切及低切均无明显影响（表6）。
3 讨论
tPA是纤溶系统的主要激活剂，它通过激活纤溶酶原形成纤溶酶而溶解纤维蛋白，生成纤维蛋白降解产物，也就是说，tPA是纤溶系统的启动因子[10]；PAⅠ-1为，tPA的生理快速抑制剂，它与，tPA以1∶1结合后使之迅速失去活性，导致纤维蛋白清除力下降、纤维蛋白沉积，同时与血管壁结合。简言之PAⅠ-1对纤溶系统起着从头抑制作用，降低tPA活性并因此减弱纤溶能力，促进血栓的形成和延展[11]。大量临床研究证实，脑梗死疾病患者血浆的PAⅠ-1活性异常增高，而tPA活性明显下降[12-13]；上述患者在恢复期，恢复程度与，tPA活性呈明显正相关，与PAⅠ-1活性呈明显负相关，说明上述患者体内纤溶活性愈低，预后愈差。经过治疗，当tPA和PAⅠ-1活性接近正常后，患者的病情也随之改善，表明PAⅠ-1是心脑血管等血栓栓塞性疾病的危险因子。本实验结果显示，高剂量的天麻醒脑胶囊可提高血栓栓塞血管的再通率，降低再栓率，中、高剂量的天麻醒脑胶囊于末次给药后60，120min均明显抑制血浆PAⅠ-1活性60～180min显著提高血浆，tPA活性。提示天麻醒脑胶囊可改善脑梗死及血管性痴呆患者tPA/PAⅠ-1的平衡，防止脑栓塞的加重，有利于血管性痴呆的改善。复方丹参滴丸采用丹参、三七原粉等名贵中药制成，研究报道，复方丹参滴丸具有增加冠状动脉血流量、降低心肌耗氧量，同时可溶栓，改善微循环等作用[14]，本实验也证明复方丹参滴丸具有较好的溶栓作用。
PT主要用于检测机体的外源性凝血系统，它的延长或缩短分别反映凝血因子Ⅶ，Ⅹ，Ⅴ，Ⅱ（凝血酶原）和，Ⅰ（纤维蛋白原）的血浆水平减低或增高[15]；另一方面KPTT则检测机体的内源性凝血系统状态，它的延长或缩短分别反映凝血因子Ⅻ，Ⅺ，前激肽释放酶，Ⅴ，，Ⅱ和Ⅰ的血浆水平减低或增高[16]。结果表明0.5，1.0g·kg-1的天麻醒脑胶囊及复方丹参滴丸显著延长KPTT和PT，明显降低Fib水平，提示天麻醒脑胶囊可影响内凝和外凝系统，减少血管壁纤维蛋白的沉积，也提示在临床用药过程中，有可能发生出血倾向，需密切监测患者的凝血系统，及时调整用药剂量或停药。
血管性痴呆的血液流变学机制，近年来已受到国内外众多学者高度重视，全血黏度增高可降低脑血流，而血液流速减慢又可导致血黏度成倍增长，最终导致血栓形成，渐成痴呆。有研究表明，血管性痴呆患者多拌有血液流变学指标异常，血液呈高凝状态，脑血流速度减慢，使脑血流量降低，导致脑灌注进一步减少，脑的能量代谢下降，从而导致血管性痴呆症状加重。因此降低血液黏稠度，改善脑循环，增加脑血流量，促进脑组织代谢对血管性痴呆的治疗极其重要[11]。全血黏度是血液流变学的重要指标，低切变率全血黏度更具有重要意义，它与血液中各种细胞的聚集性、血浆纤维蛋白原水平等因素密切相关[12]。血液是一种高分子悬浮液，其中悬浮着大量的血细胞，以红细胞为主，因此，红细胞的流变学性质是影响血流变的主要因素。本研究结果显示，3种剂量的天麻醒脑胶囊对红细胞电泳、高切、中切和低切均无明显影响，表明天麻醒脑胶囊在本实验剂量范围内对正常血液流变学相关指标无影响，是否改善高凝状态，需进一步造模研究。临床研究表明，复方丹参滴丸可降低肾病和肺心病患者的全血的高、低切变率，降低纤维蛋白原水平及红细胞电泳时间[17-18]。本实验表明复方丹参滴丸仅降低血浆纤维蛋白原水平，而对兔全血的高、中、低切变率和红细胞电泳时间等指标无明显影响，该结果与临床研究结果不一致，认为复方丹参滴丸可能对正常机体的血液流变学无明显影响，但可以改善高凝状态机体的血液流变学指标。
综上所述，天麻醒脑胶囊显著提高闭塞颈动脉的再通率，同时降低再通后颈动脉的再栓率；抑制PAⅠ-1活性，同时提高tPA的活性可能是其具有较好溶栓作用的分子机制。天麻醒脑胶囊可影响内凝和外凝系统，减少血管壁纤维蛋白的沉积，也提示在临床用药过程中，有可能发生出血倾向，需密切监测患者的凝血系统。
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内容来源：
杨建宇, 何波, 杨扬,等. 天麻醒脑胶囊的溶栓作用及对凝血系统的影响[J]. 中国中药杂志, 2009, 34(006):756-760.
