陈鹏1，金燕2，王殿华1，郑金丹3，张嘉硕1，沈志强1
（1）昆明医学院云南省天然药物药理重点实验室，昆明 650031；（2）云南省人民医院药剂科，昆明 650011；3)云南永孜堂制药有限公司，昆明 650021)
[摘要]目的 评价天麻醒脑胶囊对动物学习记忆功能的影响及其初步作用机理．方法 采用东莨菪碱、乙醇及亚硝酸钠复制小鼠和大鼠记忆障碍模型，运用避暗法研究天麻醒脑胶囊对动物学习记忆功能的影响，同时探讨其对脑组织乙酰胆碱酯酶(AChE)活性、丙二醛(MDA)及脂褐质水平的影响．结果 高、中剂量(大鼠：高剂量1.2g/kg，中剂量0.6g/kg；小鼠：高剂量2.4g/kg，中剂量1.2g/kg)的天麻醒脑胶囊能明显减少给药组大鼠及小鼠5min内的错误次数，延长触电潜伏期．高、中、低3个剂量的天麻醒脑胶囊均可减少大鼠脑组织MDA水平，降低AChE活性，同时明显抑制脑组织脂褐质含量的升高．结论 天麻醒脑胶囊通过多种途径改善记忆损伤模型动物的学习记忆功能，其机制可能与降低脑组织AChE活性，降低脑组织中脂质过氧化物、脂褐质等的含量有关．提示天麻醒脑胶囊具有良好的促智作用．
[关键词]天麻醒脑胶囊；避暗法；学习记忆；丙二醛；脂褐质；乙酰胆碱酯酶
[中图分类号]R973；R965．1
[文献标识码]A
[文章编号]1003—4706(2006)05—0036—07
老年性痴呆症又称阿尔茨海默病(alzheimer's disease，AD)．AD是发生于老年期及老年前期的一种原发性退行性脑病，以获得性、持续性记忆减退、认知功能障碍、行为异常以及人格改变为特征[1]．目前尚无特效治疗或逆转疾病进展的药物．
天麻醒脑胶囊由天麻、地龙、石菖蒲、远志、熟地黄、肉苁蓉组成．临床主要用于反应迟钝、记忆力减退、失眠、头痛、头晕、耳鸣、腰酸等症．目前尚缺乏有关本品改善学习记忆障碍的作用的文献报道．本研究通过复制记忆的获得、巩固及再现障碍多种动物模型，观察天麻醒脑胶囊的促智作用并初步探讨其可能的作用机制，旨在充分发掘、利用我国丰富的中药资源，为其I临床用于防治记忆障碍性疾病和改善学习记忆功能提供理论和实验依据.
1 材料与方法
1.1 受试药品
天麻醒脑胶囊(内容物为棕黄色粉末).规格：0.4g/粒[成人用量：2.4g(60kg/d)]，每粒含天麻以天麻素(C13H18O7)计，不得少于0.43mg．批号：20040701，生产批准文号：国药准字Z20027062，由云南永孜堂制药有限公司提供．
1.2 阳性对照品及主要试剂
尼莫地平片：规格30mg/片，批号201340912，批准文号：国药准字20~3010(用于老年性脑功能障碍的推荐剂量：90mg/d)，拜耳医药保健有限公司产品(北京)．氢溴酸东莨菪碱注射液：规格0.3mg/mL/安瓿，批号4A18101，上海禾丰制药有限公司产品．无水乙醇：规格500mL/瓶，批号20040209，天津市风船化学试剂科技有限公司产品(分析纯)．亚硝酸钠：批号20040428，规格500g/瓶，天津市东升化学试剂厂产品(分析纯)．丙二醛(malondiadehyde，MDA)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholineesterase，AChE)、脂褐质试剂盒：南京建成生物工程研究所产品．
1.3 动物
ICR小鼠，体重18～22g，雌雄均用．SD大鼠，体重180～220g，雌雄各半．均由昆明医学院实验动物中心提供．合格证号：滇实动证字第SCXK(滇)2005—008(小鼠)，SCXK(滇)2005—008(大鼠)．
1.4 主要仪器
SBA一2型程控小鼠避暗箱，DBA一2型程控大鼠避暗箱均为北京中国医科院药物研究所产品．GF一1型高速分散器购自江苏海门麒麟医用仪器厂．RF一5000型荧光分光光度计，Et本岛津公司产品．EL340型全自动酶标仪。美国Bio—TekInstruments公司产品．
1.5 方法
1.5.1 给药途径
小鼠以0.2mL/10g体重灌胃，大鼠以1mL/100g体重灌胃，正常对照组和模型对照组以等容量生理盐水灌胃．各组动物每日灌胃给药2次，连续15d．各组动物均于末次给药1h后进行学习记忆功能的训练与测试．
1.5.2 分组与剂量设置依据[2]
将ICR小鼠和SD大鼠分别随机分为6组，小鼠每组15只(雌雄均用)，大鼠每组10只(雌雄各半)，即正常对照组、模型组、天麻醒脑胶囊低剂量组(小鼠剂量为0.6g/kg，大鼠剂量为0.3g/kg)、天麻醒脑胶囊中剂量组(小鼠剂量为1.2g/kg，大鼠剂量为0.6g/kg)、天麻醒脑胶囊高剂量组(小鼠剂量为2.4g/kg，大鼠剂量为1.2g/kg)、尼莫地平片阳性对照组(小鼠剂量为0.05g/kg，大鼠剂量为0.025g/kg)．剂量设置依据：天麻醒脑胶囊临床成人(60kg体重)剂量为40mg/kg，按人与动物体重体表面积折算，理论上小鼠明显有效剂量应为0.6g/kg，大鼠等效剂量为0.3g/kg．本研究预试验结果表明，1.2g/kg的天麻醒脑胶囊明显延长小鼠避暗潜伏期并减少5min内错误次数(东莨菪碱致记忆获得障碍)，而0.6g/kg天麻醒腑胶囊则无明显影响．故本研究中，以1.2g/kg作为本品的小鼠明显有效剂量，大鼠为0.6g/kg．尼莫地平片成人剂量为1.5mg/kg，理论上，小鼠等效剂量应为22.5mg/kg，但预试验表明50mg/kg的尼莫地平片可明显延长小鼠避暗潜伏期并减少5min内错误次数(东莨菪碱致记忆获得障碍)，而22.5mg/kg的尼莫地平片则无明显影响．故选用50mg/kg作为尼莫地平片的小鼠明显有效剂量，25mg/kg作为大鼠明显有效剂量．
1.5.3 动物避暗法
小鼠SBA一2型程控避暗箱体积为20cmx13cmx35cm的5问反应箱，分明暗两室，两室隔板底部有一直径为3cm的圆形洞口．明暗箱底部均装有铜栅，暗箱底部铜栅通以36V电流，明箱底部铜栅不通电．训练时将每批5只小鼠分别放人明室，先适应环境3min，然后通电，小鼠因嗜暗习性钻人暗室则遭受电击，此时小鼠可自行逃出暗室返回明室，从而获得记忆，如此训练5min．24h后重新测试，测试时先通电，然后将小鼠背对洞口放人明室，同时开始记时，记录小鼠从放人明室至第1次进入暗室遭到电击的时间(即为潜伏期)及5min内进入暗室的错误次数，作为观察指标[3，4]．
大鼠DBA一2型程控避暗箱为两问反应箱，分为明暗两室，结构类似小鼠程控避暗箱．训练时将每批2只大鼠分别放人明室适应环境3min，然后通电[5，6]．训练及测试过程均同小鼠．
1.6 统计学处理
采用SPSS11.5统计软件包进行统计学处理，实验数据用均数±标准差表示，每个样本均数组问两两比较采用单因素方差分析和q检验，以P值小于0.05为有统计学意义．
2 结果
2.1 对东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍的影响
小鼠于末次给药1h后进行训练，训练前20min，模型组和给药组分别以0.1mL/10g体重腹腔注射氢溴酸东莨菪碱3mg/kg，正常对照组腹腔注射等容量生理盐水．24h后重新测试．结果表明，模型组与正常组比较，小鼠潜伏期明显缩短，5min内错误次数明显增加，说明避暗法东莨菪碱致小鼠记忆获得障碍模型造型成功；与模型组相比，天麻醒脑胶囊中、高两个剂量组(1.2和2.4g/kg)的潜伏期显著延长，5min内错误次数明显减少(见表1)．
2.2 对4O％乙醇所致小鼠记忆再现障碍的影响
各组小鼠于末次给药1h后进行训练，24h后重新测试．测试前30min模型组和给药组分别灌胃40%乙醇0.1mL/10g体重，正常对照组灌胃等容积生理盐水．结果表明，模型组与正常组比较，小鼠潜伏期明显缩短，5min内错误次数明显增加，说明避暗法记忆再现障碍模型造型成功；与模型组相比，天麻醒脑胶囊中、高两个剂量组的5min内错误次数明显减少，3种剂量的天麻醒脑胶囊显著延长潜伏期(见表2)．
2.3 对亚硝酸钠所致小鼠记忆巩固障碍的影响
各组小鼠于末次给药1h后进行训练，模型组和给药组训练结束后分别立即以0.1mL/lOg体重皮下注射亚硝酸钠120mg/kg，正常对照组皮下注射等容量生理盐水，24h后进行测试．结果表明，模型组与正常组比较，其潜伏期明显缩短，5min内错误次数明显增加，说明避暗法记忆巩固障碍模型造型成功；与模型组相比，中、高两个剂量的天麻醒脑胶囊显著延长潜伏期，明显减少5min内错误次数(见表3)．
2.4 对东莨菪碱所致大鼠记忆获得障碍的影响
大鼠于末次给药1h后进行训练，训练前20min模型组和给药组分别以1mL/lO0g体重腹腔注射氢溴酸东莨菪碱3mg/kg，正常对照组腹腔注射等容量生理盐水．24h后重新测试．结果显示：模型组与正常组比较，大鼠潜伏期明显缩短，5min内错误次数明显增加，说明避暗法东莨菪碱致大鼠记忆获得障碍模型造型成功；与模型组相比，天麻醒脑胶囊中、高两个剂量组(0.6和1.2g/kg)的潜伏期显著延长，5min内错误次数明显减少(见表4)．
2.5 对40％乙醇所致大鼠记忆再现障碍的影响
各组大鼠于末次给药1h后进行训练，24h后重新测试．测试前30min模型组和给药组分别灌冒40%乙醇1mL/lO0g体重，正常对照组灌胃等容积生理盐水．结果显示：模型组与正常组比较，大鼠潜伏期明显缩短，5min内错误次数明显增加，说明避暗法大鼠记忆再现障碍模型造型成功；与模型组相比，三种剂量的天麻醒脑胶囊显着延长潜伏期，明显减少5min内错误次数(见表5).
2.6 天麻醒脑胶囊对大鼠脑组织MDA、脂褐质含量和AChE活力的影响[7]
上述东莨菪碱致大鼠记忆获得障碍行为学实验完成后，继续注射东莨菪碱5d并灌胃给药5d．断头处死动物，迅速于冰盒上取其全脑(去小脑)，称重，用灭菌生理盐水匀浆制成10%脑匀浆，分别按丙二醛(MDA)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、脂褐质试剂盒说明进行活力测定．结果表明，与模型组比较，高剂量的天麻醒脑胶囊可减少脑组织MDA水平、抑制脑组织脂褐质含量的升高，中、高剂量的天麻醒脑胶囊明显降低AChE活性(见表6)．
3 讨论
学习记忆是大脑的最高级功能之一，是构成智能的重要要素．学习与记忆是两个不同而又密切联系的神经生物学过程，学习是指新行为(经验)的获得和发展；通过学习获得经验的保持和再现，这就是记忆．记忆根据心理学特点和神经生理生化机制可分为四个阶段：识记或获得，是指通过学习在大脑留下记忆痕迹的过程；贮存和巩固以及保持，这两个过程均为学习训练后发生的记忆痕迹由短时不稳定状态逐渐转化为长时牢固状态并贮存下来的过程；再现，是指存贮在脑内的记忆痕迹通过回忆或再现方式加以重现的过程[8]．
根据学习记忆的生理生化基础，本研究选用不同化学物质造成记忆缺损模型，观察天麻醒脑胶囊对学习记忆不同阶段的影响．M胆碱受体阻滞剂东莨菪碱可阻断大脑皮层和海马胆碱能传递，能特异性阻滞信息由第一级记忆向第二级记忆的转移过程，抑制条件反射的形成，影响学习记忆等机能活动，从而干扰了获得新近信息(近期记忆)的能力．训练前给药，可造成动物记忆获得障碍[9]．本研究采用避暗法探讨天麻醒脑胶囊对东莨菪碱引起的记忆获得障碍的影响，结果表明，中、高剂量的天麻醒脑胶囊均明显减少5min内小鼠和大鼠的错误次数，显著延长小鼠和大鼠的潜伏期．结果提示，天麻醒脑胶囊可明显改善动物的记忆获得性障碍，说明其具有的这种胆碱能样效应可能与调节脑内胆碱能神经、肾上腺能神经系统的功能，是否与提高皮层下降的M受体和单胺类神经递质含量有关，本研究组将进一步探讨．
亚硝酸钠为致脑缺氧剂，可引起动物脑组织缺氧，造成脑缺血性记忆巩固不良．训练后给药，可造成记忆巩固障碍[9]．实验结果显示，中、高剂量的天麻醒脑胶囊均明显减少5min内小鼠的错误次数，显著延长小鼠的潜伏期．结果表明，天麻醒脑胶囊具有促进记忆巩固的作用，可明显改善亚硝酸钠所致小鼠缺氧性记忆巩固不良反应，其抗缺氧作用可能与天麻醒脑胶囊能增加脑血流，改善缺氧时的能量代谢有关．
乙醇为中枢性抑制剂，灌服40%的乙醇主要导致动物记忆的再现障碍，测试前给药，较低浓度下即可明显破坏记忆过程，造成学习记忆再现障碍j．结果表明，中、高剂量的天麻醒脑胶囊均明显减少5min内小鼠和大鼠的错误次数，显著延长小鼠和大鼠的潜伏期．提示天麻醒脑胶囊具有促进记忆再现的作用，可能与增进皮层细胞兴奋性，增强中枢神经自主活动有关．
ACh是中枢胆碱能系统中重要的神经递质之一，其主要功能是维持意识的清醒，促进学习和记忆的改善．ACh是由胆碱、乙酰辅酶A等在胆碱乙酰转移酶(choline—acetyl—transfertase，ChAT)的催化下合成，由AChE分解．ChAT和AChE共同维持ACh的动态平衡．由于老年性痴呆患者基底前脑胆碱能神经元缺失后神经递质ACh的减少，是导致学习记忆功能下降最直接的病理基础[10]．同时AD患者体内组织细胞中自由基代谢平衡失调，机体对自由基的防御能力下降．过量自由基可使生物膜脂质双层中的不饱和脂肪酸过氧化，而形成脂质过氧化产物．过氧化脂质的代谢产物MDA进一步与磷脂酰乙醇胺和蛋白质交联，生成无活性的脂褐质，沉积于组织细胞，使RNA持续降低，破坏细胞膜结构，最后导致细胞无法维持正常代谢而死亡[11]．本实验结果显示，天麻醒脑胶囊可以通过降低AChE活性而减少ACh降解，从而增强胆碱能系统功能，使模型鼠学习记忆得以改善．天麻醒脑胶囊还可以降低脑内自由基水平，显著降低脂质过氧化终产物MDA的含量，进而减少了脂褐质脑内沉积对脑代谢及功能的影响．这可能是天麻醒脑胶囊促智作用的初步机理之一．
综上所述，天麻醒脑胶囊通过多种途径改善记忆损伤模型动物的学习记忆功能．其机制nr能与降低脑组织AChE活性，降低脑组织中脂质过氧化物MDA及脂褐质的含量有关．本研究为天麻醒脑胶囊用于防治学习记忆功能障碍提供了临床前药理学实验依据．
内容来源：
陈鹏, 金燕, 王殿华,等. 天麻醒脑胶囊对学习记忆功能的影响及机理研究[J]. 昆明医科大学学报, 2006, 27(005):36-42.
